26.08.2010

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Quantifizierung einer ungewollten Auskreuzung von Plastidengenen

(2008 – 2011) Fachbereich Agrobiotechnologie - Institut für Landnutzung (ILN) - Agrar- und Umweltwissenschaftliche Fakultät - Universität Rostock

Thema

Neue Forschungsansätze zielen darauf ab, Pflanzen nicht im Zellkern, sondern in den Plastiden gentechnisch zu verändern. Plastiden sind kleine Einheiten in der Pflanzenzelle, die über eigene DNA verfügen. Einer der Vorteile der Plastidentransformation: Die Erbinformation der Plastiden wird nicht über den Pollen weitergegeben, eine mögliche Ausbreitung der neu eingebrachten Gene damit verhindert und das Erbgut in der Pflanze biologisch eingeschlossen (biologisches Confinement).

Ziel dieses Projektes ist es, die Zuverlässigkeit eines solchen Confinement-Systems zu überprüfen. Da es Hinweise auf eine gewisse „Undichtigkeit“ des Confinement-Systems „Plastid“ gibt, soll an den Modellpflanzen Petunie und Arabidopsis in Freilandversuchen die Häufigkeit eines (unerwünschten) Gentransfers von Plastiden-DNA über den Pollen abgeschätzt werden.

Informationen zum Verfahren:

Versuchsbeschreibung

Die Plastidentransformation eignet sich als Confinement-Methode nur dann, wenn die ins Plastidengenom übertragenen Transgene bei der Vererbung dauerhaft in wesentlich geringerer Häufigkeit über den Pollen auf die nächste Generation übertragen werden.

Kreuzungsversuche mit Petunie, Arabidopsis und Raps

Da erst im Verlauf des Forschungsvorhabens transplastomische Raps- und Maislinien vorliegen, werden die Untersuchungen zur Häufigkeit einer Pollenverbreitung von Plastiden-DNA in den ersten beiden Versuchsjahren an den Modellpflanzen Petunie und Arabidopsis im Freiland vorgenommen. Für das dritte Versuchsjahr sind für Raps Gewächshausuntersuchungen geplant.

Die Versuche sind so angelegt, dass mit einer hohen Genauigkeit das Ereignis eines Pollentransfers von Plastiden-DNA festgestellt werden kann. Zu diesem Zweck werden im Streifenanbau Pollenspender- und Empfängerpflanzen nebeneinander ausgepflanzt.

Die Petunien-Spenderlinien sind gentechnisch verändert. Sie sind mit Markergenen (Antibiotikaresistenz) und einem Reporter-Gen (GUS-Gen) im Plastidengenom ausgestattet. Als Pollenempfänger werden konventionelle Linien eingesetzt. Ist das Reporter-Gen in den Nachkommenschaften der konventionellen Linien feststellbar, hat ein Transfer von Plastiden-DNA über den Pollen stattgefunden.

Die Arabidopsis-Spenderlinien sind dagegen nicht gentechnisch verändert, weisen jedoch aufgrund einer Punktmutation eine Herbizidresistenz im Plastiden auf. Um einen möglichst hohen Samenansatz über eine Fremdbestäubung zu erzielen, werden in fünfzig Prozent der Parzellen männlich sterile Arabidopsis-Pflanzen, die keinen eigenen Pollen produzieren, als Empfängerpflanzen angepflanzt.

Für den Nachweis des Gentransfers werden die Samen der Empfängerpflanzen geerntet, im Gewächshaus angezogen und mit Hilfe eines Farbtests (GUS-Test) auf das Vorhandensein des Reporter-Gens geprüft. Es ist geplant, Samen in großem Umfang (mindestens 300.000 Stück) zu untersuchen, um mit hoher statistischer Absicherung Aussagen zur Eintrittswahrscheinlichkeit des (unerwünschten) Ereignisses eines Pollentransfers von Plastiden-DNA treffen zu können.

Das Projekt ist Teil des Verbundprojektes CONFICO „Entwicklung und Prüfung von Plastidentransformation als Confinement-System bei Raps und Mais“. Beteiligt sind der Lehrstuhl für Botanik (Prof. Dr. Dario Leister), die Arbeitsgruppe für Zellbiologie und Zellkultur (Prof. Dr. Hans-Ulrich Koop) der Universität München, der Lehrstuhl für Genetik (Prof. Dr. Alfons Gierl) der Technischen Universität München und der Lehrstuhl für Agrobiotechnologie (Prof. Dr. Inge Broer) der Universität Rostock.

Ergebnisse

Arabidopsis thaliana: Im Spätsommer 2008 fand der erste Freilandversuch mit Arabidopsis statt, der im Juni 2009 nach dem gleichen Versuchsaufbau wiederholt wurde. Die Parzellen wurden abwechselnd mit einer bzw. drei Reihen der herbizidresistenten Arabidopsis-Spenderlinien und jeweils einer Reihe der männlich sterilen Empfängerlinien bepflanzt.

Nach der Ernte wurde die Saatgutmenge der Empfängerpflanzen bestimmt: Im Jahr 2009 betrug der Ertrag 1.209.190 Samen, dies entspricht nur einem Viertel der Menge von 2008 (4.655.477). Ursache für den geringeren Samenertrag war vermutlich das deutlich schnellere Abreifen der Arabidopsis-Pflanzen durch höhere Temperaturen gegenüber 2008. Die Samen werden zur Zeit von einem Verbundpartner (AG Leister) untersucht.

Petunien: Aufgrund von Verzögerungen bei der Freisetzungsgenehmigung wurden 2009 erst im August 8670 Petunien ausgepflanzt.

Der Versuchsaufbau entsprach dem von Arabidopsis in den Jahren 2008 und 2009. Die lilafarbenen transplastomen Linien (T16) waren die Pollenspender, die weiß blühenden konventionellen Linien (W115) die Pollenempfänger. Auf dem Kontrollfeld diente die isogene Variante (Pink Wave) als Pollenspender und wiederum die konventionelle Linie als Empfänger.

Im Jahr 2009 wurden insgesamt 12.400 Blüten markiert, bei den weiblichen Blüten die Blüten- und Staubblätter entfernt und diese anschließend mit den transgenen Petunien manuell bestäubt. Die Anzahl der geernteten Kapseln betrug 1440, das entspricht einer Samenmenge von ca. 900.000.

Aus den Samen wurden anschließend im Gewächshaus bei Dunkelheit und einer Temperatur von 18-24 Grad Keimlinge angezogen. Zur Zeit wird mit Hilfe eines GUS-Farbtests untersucht, ob eine väterliche Plastidenvererbung stattgefunden hat. Weisen die Keimlinge blau gefärbte Bereiche auf, wird mit molekularbiologischen Methoden (PCR) untersucht, ob auch tatsächlich die transgene Gensequenz enthalten ist.