01.07.2010

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Entwicklung einer Technik zur zielgerichteten Integration von Genen bei Pflanzen

(2008 – 2011) Universität Karlsruhe, Botanisches Institut, Lehrstuhl für Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen

Thema

Bei der Übertragung neuer Gene in Pflanzen ist nicht vorhersehbar, an welcher Stelle sie in das Genom eingebaut werden. Dadurch können andere Gene in ihrer Funktion beeinflusst werden. Ein gezielter Einbau an bekannten und gut definierten Stellen im Genom könnte diese Unsicherheit ausschließen.

Ziel dieses Projektes ist es, eine Technik weiterzuentwickeln, mit der ein Transgen spezifisch an jeder gewünschten Stelle in ein Pflanzengenom integriert werden kann (Gene targeting). Grundlage für diese Technik ist die homologe Rekombination, ein natürlich vorkommender Mechanismus zur Neukombination des Erbguts. Die bisher entwickelten Gene Targeting-Techniken für Pflanzen funktionieren noch nicht effizient, d.h. das Transgen wird zu selten zielgerichtet in das Pflanzengenom eingebaut.

In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana konnten drei Gene (BRCA1, BRCA2 und BARD1) identifiziert werden, deren Ausfall dazu führt, dass deutlich weniger homologe Rekombinationsereignisse stattfinden. In dem hier beschriebenen Ansatz soll nun versucht werden, durch eine überhöhte Expression dieser Gene einen Anstieg homologer Rekombinationsereignisse zu erreichen. Wenn das gelingt, soll an zwei verschiedenen Gene targeting-Systemen getestet werden, ob diese Technik dadurch effizienter funktioniert.

Vorläuferprojekt:

Informationen zum Verfahren:

Versuchsbeschreibung

In einem ersten Schritt werden Arabidopsis-Pflanzen mit den drei genannten Genen transformiert (vgl. Transformation), und zwar sowohl einzeln als auch in verschiedenen Kombinationen. Die Überexpression der Gene wird durch die Wahl geeigneter Steuerelemente (Promotoren) herbeigeführt. Mit molekularbiologischen Methoden werden die Orte im Pflanzengenom untersucht, an der die Gene eingebaut wurden. Mit Hilfe einer Farbreaktion wird getestet, welche Gene bzw. Genkombinationen zu einem Anstieg homologer Rekombinationsereignisse führen. Diese Pflanzen bzw. Genkonstrukte werden für die weiteren Versuche ausgewählt, in denen untersucht wird, ob sich die Effizienz des Gene targeting in zwei verschiedenen Testsystemen verbessern lässt.

Rot fluoreszierende Samen. Das in die Pflanzen eingebrachte Reportergen exprimiert in den Samen ein Protein, das rot leuchtet, wenn es mit geeignetem Licht angeregt wird.

Messung der Effizienz des Gene targeting

Im ersten System werden die ausgewählten Pflanzen mit einem weiteren Genkonstrukt transformiert, das ein Reportergen trägt. Das Reportergen ist von Teilsequenzen eines Gens umgeben, das im Genom von A. thaliana vorkommt und ausschließlich in Samen exprimiert wird. An der Stelle, an der dieses Gen sich im Pflanzengenom befindet, wird durch homologe Rekombination das Reportergen eingebaut und dann ebenfalls in Samen – und nur dort – exprimiert. War das Gene targeting erfolgreich, bilden diePflanzen rot fluoreszierende Samen. Diese können sehr einfach unter einem Fluoreszenz-Binokular identifiziert und weiter untersucht werden.

Zum anderen wird ein Gene targeting-System untersucht, das im Vorläuferprojekt entwickelt wurde. Dabei werden zwei Pflanzenlinien gentechnisch verändert und anschließend miteinander gekreuzt. Das Genom der einen Linie enthält einen bekannten und gut untersuchten Zielort, an dem ein Transgen eingebaut werden soll, das Genom der anderen Linie enthält das Transgen, umgeben von DNA-Abschnitten, deren Sequenzen zum Zielort homolog sind. Bei der Kreuzung soll das Transgen durch homologe Rekombination am Zielort eingebaut werden, was mit Hilfe eines Reportergens und eines Antibiotikaresistenzgens nachgewiesen werden kann. Im Vorläuferprojekt konnte dieser Einbau jedoch letztendlich noch nicht nachgewiesen werden.

Die beiden Ausgangslinien aus dem Vorläuferprojekt sollen nun mit denjenigen Genkonstrukten aus dem ersten Teilversuch transformiert werden, mit denen ein Anstieg homologer Rekombinationsereignisse erreicht werden konnte. Dann sollen die beiden Linien erneut gekreuzt werden, um zu testen, ob der Einbau des Transgens effizienter funktioniert als im Vorläuferprojekt.

Ergebnisse

Es wurden Genkonstrukte mit unterschiedlichen Promotoren (Ubiquitin-Promotor oder doppelter 35S-Promoter) hergestellt, die eine Überexpression der Gene BRCA1 und BARD1 hervorrufen sollten. Zusätzlich enthielten die Konstrukte Antibiotikaresistenzgene. Mit diesen Konstrukten wurden Arabidopsis-Pflanzen transformiert. Durch anschließende Selektion auf einem Antibiotika-haltigen Nährmedium (PPT) konnten mehrere transgene Linien identifiziert werden. Diese wurden durch Selbsten vermehrt, um die Nachkommen erneut einzeln auf dem Nährmedium selektieren zu können. Ziel war es, Nachkommen zu erhalten, die die transgene DNA nur an einem einzigen Ort im Genom enthalten. So sollten unerwünschte Effekte wie eine Inaktivierung des Transgens verhindert werden.

Die Nachkommen der transformierten Pflanzen konnten auf dem PPT-haltigen Nährmedium nicht wachsen. Offenbar war es zu einer Inaktivierung des Resistenzgens gekommen. Als Grund wird eine zu hohe Zahl von 35S-Promotoren im Pflanzengen vermutet. Zur Zeit werden transgene Arabidopsis-Linien hergestellt, die deutlich weniger 35S-Promotoren enthalten. Erste Segregationsanalysen zeigen, dass die zuvor beobachtete Inaktivierung des Markergens nun nicht mehr auftritt.

Außerdem sollte ein Genkonstrukt hergestellt werden, das in Arabidopsis eine Überexpression des BRCA2-Gens auslöst. Diese Arbeiten sind auf Grund experimenteller Schwierigkeiten noch nicht abgeschlossen.