05.07.2010

Forschung Projekte

Versenden

Verhinderung der Ausbreitung von gentechnisch veränderten Pappeln durch transgen-freien Pollen

(2008 – 2011) Johann Heinrich von Thünen-Institut, Institut für Forstgenetik Großhansdorf

Thema

Bereits seit einigen Jahren wird über eine Verwendung gentechnisch veränderter Pappeln im kommerziellen Plantagenanbau, zum Beispiel als nachwachsende Rohstoffe, diskutiert. Bei der Sicherheitsbewertung gentechnisch veränderter Pflanzen spielt die mögliche Übertragung der neu eingeführten Gene über Pollen oder Samen eine wichtige Rolle. Weltweit werden daher Strategien entwickelt, die sich damit befassen, wie sich der Gentransfer durch Pollen oder Samen gezielt verhindern lässt (biologisches Confinement).

In diesem Teilprojekt sollen vermehrungsfähige transgene Pappeln erzeugt werden, deren Pollen jedoch transgen-frei ist. Dazu werden Rekombinasen benutzt, spezielle Enzyme, mit denen man gezielt DNA-Abschnitte aus dem Pflanzengenom ausschneiden kann.

Mit dem hier beschriebenen Ansatz soll erreicht werden, dass das Transgen während der Pollenbildung aus dem Genom herausgeschnitten wird. Dieses Herausschneiden kann zu einem frei wählbaren Zeitpunkt im Lebenszyklus der Pflanze durch eine Wärmebehandlung eingeleitet werden. So ist gewährleistet, dass das Transgen während der Züchtung im Pflanzengenom verbleibt. Das Saatgut, das für den kommerziellen Anbau vorgesehen ist, wird einer Wärmebehandlung unterzogen, bevor es abgegeben wird. Daraus sollen dann Pappeln hervorgehen, die die gentechnische Veränderung in allen Geweben mit Ausnahme des Pollens tragen.

Vorläuferprojekt:

Informationen zum Verfahren:

Versuchsbeschreibung

Jede Rekombinase erkennt eine spezifische DNA-Sequenz. Will man mit Hilfe einer Rekombinase einen bestimmten Abschnitt aus dem Genom entfernen, so muss dieser Abschnitt von zwei Erkennungssequenzen eingeschlossen sein. Rekombinase und Erkennungssequenz werden zusammen als Rekombinationssystem bezeichnet.

Durch die Wahl des Steuerelementes (Promotors) für das Rekombinase-Gen können Ort oder Zeit der Rekombination bestimmt werden. In diesem Projekt werden Pappellinien erzeugt, bei denen zwei Rekombinasen mit unterschiedlichen Promotoren zum Einsatz kommen. Das Gen für die erste Rekombinase steht unter der Kontrolle eines Promotors, der durch Wärme aktiviert wird, d.h. erst nach einer Wärmebehandlung, die zu jedem beliebigen Zeitpunkt stattfinden kann, wird das Gen abgelesen und die erste Rekombinase gebildet. Sie schneidet einen DNA-Abschnitt aus dem Genom heraus, der den Promotor für das zweite Rekombinase-Gen blockiert. Erst dann kann die zweite Rekombinase gebildet werden. Der zweite Promotor ist pollenspezifisch, d.h. die zweite Rekombinase wird nur im sich entwickelnden Pollen gebildet. Dort schneidet sie das Transgen aus dem Pflanzengenom heraus.

Um das beschriebene Verfahren zu testen, werden Zitterpappeln mit einem Genkonstrukt transformiert, das neben den beiden Rekombinationssystemen ein Reportergen zum Nachweis der zweiten Rekombination enthält. Das Reportergen wird hier anstelle eines Transgens eingesetzt, um den Erfolg des Systems sichtbar zu machen. Darüber hinaus enthält das Genkonstrukt zwei Markergene: ein Herbizidresistenzgen zum Nachweis der Transformation und ein Antibiotikaresistenzgen zum Nachweis der zweiten Rekombination.

Herstellung transgener Pappellinien

Die Untersuchungen werden an frühblühenden Pappellinien aus dem Vorläuferprojekt durchgeführt. Blattstücke dieser Pappeln werden transformiert und in einer Klimakammer auf einem speziellen Nährmedium kultiviert. Aus jedem Blattstück entwickelt sich ein Kallus, aus dem unter geeigneten Bedingungen wieder eine Pappelpflanze wächst.

1. Rekombinationssystem - Aktivierung des hitzeinduzierbaren Promoters

Ein Hitzeschock aktiviert in den Pflanzen die erste Rekombinase und der DNA-Abschnitt zwischen ihren Erkennungssequenzen wird aus dem Genom der Pflanzen herausgeschnitten. Dadurch gelangt die zweite Rekombinase unter den Einfluss des pollenspezifischen Promoters. Das wird mit molekularbiologischen Analysen (PCR und Southern-Blot) nachgewiesen.

2. Rekombinationssystem - Aktivierung des pollenspezifischen Promoters

Pflanzen mit erfolgreicher erster Rekombination werden bis zur Blüte im Gewächshaus kultiviert. Während der Pollenbildung kommt es dann zur Aktivierung der zweiten Rekombinase. Das Herausschneiden des Reportergens, wird wiederum mit molekularbiologischen Methoden (PCR, Southern Blot) nachgeprüft. Darüberhinaus wird der Pollen mit einer Substanz versetzt, die zu einem blauen Farbstoff umgesetzt wird, wenn das Reportergen vorhanden ist. Je mehr ungefärbter Pollen vorhanden ist, desto effektiver war die zweite Rekombination.

Ergebnisse

Herstellung transgener Pappellinien

Die frühblühenden Pappeln wurden erfolgreich mit verschiedenen Genkonstrukten transformiert. Mit Southern-Blot-Analysen konnten Linien identifiziert werden, die das Konstrukt nur einmal im Genom tragen. Das ist für die weitere Arbeit wichtig, um unerwünschte Effekte wie die Inaktivierung des Transgens zu verhindern.

1. Rekombinationssystem - Aktivierung des hitzeinduzierbaren Promoters

Blatt- und Sprossmaterial der erfolgreich transformierten Linien wurde 24 Stunden bei 40°C hitzebehandelt. PCR-Analysen zeigten, dass die Rekombination nicht in allen Zellen statt gefunden hat. Zurzeit wird an der Optimierung der Hitzebehandlung gearbeitet.