09.03.2009

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Transgene Zitterpappeln: Überprüfung der Zuverlässigkeit männlicher Sterilitätssysteme

(2008 – 2011) Johann Heinrich von Thünen-Institut, Institut für Forstgenetik Großhansdorf

Thema

Bereits seit einigen Jahren wird über eine Verwendung gentechnisch veränderter Pappeln im kommerziellen Plantagenanbau, zum Beispiel als nachwachsende Rohstoffe, diskutiert. Bei der Sicherheitsbewertung gentechnisch veränderter Pflanzen spielt die mögliche Übertragung der neu eingeführten Gene über Pollen oder Samen eine wichtige Rolle. Weltweit werden daher Strategien entwickelt, die sich damit befassen, wie sich der Gentransfer durch Pollen oder Samen gezielt verhindern lässt (biologisches Confinement).

In diesem Teilprojekt soll die Zuverlässigkeit eines für die Zitterpappel entwickelten Confinement-Systems überprüft werden. Untersucht werden transgene Zitterpappeln aus einem Vorläuferprojekt. Sie enthalten Genkonstrukte, die eine männliche Sterilität hervorrufen sollen. Die verwendeten Gene enthalten die Informationen für bestimmte Zytotoxine (Zellgifte). Durch die Wahl gewebespezifischer Steuerelemente (Promotoren) soll erreicht werden, dass die Expression dieser Gene nur in den Antheren (Staubbeuteln) erfolgt.

Folgende Fragestellungen werden untersucht:

• Wird Pollen gebildet?
• Ist eventuell gebildeter Pollen keimfähig?
• Werden die Zytotoxingene ausschließlich in den Antheren oder auch in anderen Geweben wie Blatt, Spross oder Wurzel exprimiert?

Vorläuferprojekt:

Informationen zum Verfahren:

Versuchsbeschreibung

Untersucht werden etwa zweihundert transgene, im Gewächshaus kultivierte Zitterpappeln aus einem Vorläuferprojekt. Sie sind mit sechs verschiedenen Genkonstrukten ausgestattet, bei denen insgesamt vier verschiedene Zytotoxingene und vier verschiedene Promotoren zum Einsatz kommen. Da Pappeln üblicherweise erst nach acht Jahren blühen, enthält ein Teil dieser Linien zusätzlich ein „Frühblühgen“.

Molekularbiologische Untersuchungen

Mit Hilfe von PCR und Southern Blot sollen zunächst die Orte im Pflanzengenom, an denen ein Genkonstrukt eingebaut wurde, untersucht werden.

Weiterhin wird geprüft, ob die eingeführten Zytotoxingene, wie gewünscht, nur in den Antheren exprimiert werden oder auch in anderen Geweben. Dazu benutzt man eine besondere Form der PCR (RT-PCR), die die Kopienzahl spezifischer RNA-Sequenzen misst und Rückschlüsse darauf erlaubt, ob und wie stark ein Gen exprimiert wird.

Mikroskopische Untersuchungen und Keimfähigkeitstests

Die transgenen Pappeln werden ganzjährig auf ihre Blütenbildung hin untersucht. Alle Blüten werden vor der Pollenreifung eingetütet, sodass sich eventuell fruchtbarer Pollen nicht ausbreiten kann. Mit Hilfe mikroskopischer Untersuchungen und Anfärbung der Blüten wird die Anwesenheit von Pollen überprüft und quantifiziert.

Die Keimfähigkeit des geernteten Pollens wird entweder direkt durch Kreuzung mit weiblichen Narben getestet oder durch Aufbringen des Pollens auf Agar-beschichtete Objektträger. Die gegebenenfalls aus der Kreuzung erhaltenen Sämlinge werden anschließend molekular analysiert.

Ergebnisse

Die verwendeten Sterilitätskonstrukte haben bisher keine erkennbar negativen Auswirkungen auf das Wachstum der Pflanzen gezeigt. Transgene frühblühende Pappeln lieferten erste Ergebnisse über die Funktionalität der Konstrukte. Auch konnte ein natürlicherweise frühblühender Pappelklon mit in die Untersuchungen aufgenommen und mit Zytotoxingenen transformiert werden.

An den transgenen frühblühenden Pappel-Linien konnte die Auswirkung verschiedener Sterilitätskonstrukte auf die Antheren- und Pollenentwicklung untersucht werden. Die Antheren beinhalteten entweder keine oder nur sehr wenige Pollenkörner. Auf Basis von drei verschiedenen Vitalitäts-Tests wurde gezeigt, dass ein Teil der gebildeten Pollenkörner lebendig waren.

Bei einem Sterilitätskonstrukt konnte die Aktivität des Zytotoxingens bestätigt und in Blütenknospen mit RT-PCR nachgewiesen werden. Die Untersuchungen zeigten, dass 70% der Blüten pollenfrei waren. Bei den restlichen Blüten waren die Pollenkörner vital und bestäubungsfähig. Die Gründe für diese Variabilität werden zurzeit im Labor untersucht.

Für die normal blühenden Pappellinien, die mit Zytotoxingenen transformiert wurden, werden erste Blüten werden in den nächsten Jahren erwartet.