08.06.2010

Forschung Projekte

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Herstellung eines Bt-Proteinstandards und Optimierung der Nachweismethoden

(2008 – 2011) Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum (DLR) Rheinpfalz, Abteilung Phytomedizin, Neustadt an der Weinstraße

Thema

Für den Verbund der Sicherheitsforschungsprojekte zu gentechnisch verändertem Bt-Mais (MON89034 x MON88017), der drei verschiedene Bt-Proteine bildet, werden

• standardisierte Bt-Proteine hergestellt und
• eine einheitliche Messmethode entwickelt und etabliert, mit der die jeweilige Menge der in Maispflanzen gebildeten Bt-Proteine erfasst werden kann.

Bt-Proteinstandards und eine einheitliche Methode zum quantitativen Nachweis der Toxine sind notwendig, damit die Ergebnisse der verschiedenen Teilprojekte vergleichbar sind.

Der produzierte Bt-Proteinstandard wird den Projekten des Verbundes zur Verfügung gestellt.

Versuchsbeschreibung

Herstellung der Bt-Proteine

Um größere Mengen der Bt-Proteine herstellen zu können, werden die Gene, die die Information dafür tragen, isoliert und in Kolibakterien (Escherichia coli) eingeschleust. Kultiviert man die Bakterien unter geeigneten Bedingungen, produzieren sie die Bt-Proteine.

Der Bt-Mais wird für vier bis sechs Wochen im Gewächshaus herangezogen. Dann werden die jungen Blätter der Pflanze geerntet und daraus die DNA isoliert. Aus der Gesamt-DNA der Maispflanzen werden die Gene für die Bt-Proteine mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) selektiv vervielfältigt. Anschließend wird jedes Gen in ein Plasmid eingebracht, das in Bakterien eingeschleust wird.

Die Bakterien werden kultiviert und die von ihnen produzierten Bt-Proteine isoliert und gereinigt. Anschließend werden ihre Konzentration und ihr Reinheitsgrad bestimmt. Für jedes Bt-Protein müssen die Bedingungen für die Kultivierung, Isolierung, Reinigung und Lagerung gesondert optimiert werden. Außerdem müssen die in E.coli produzierten Proteine immunologisch charakterisiert werden, um sicherzustellen, dass sie mit den Proteinen aus den gentechnisch veränderten Pflanzen vergleichbar sind.

Aus dem letzten Projekt steht bereits ein Bakterienstamm zur Verfügung, der eins der drei Bt-Proteine produziert.

Kontrolle der Bioaktivität der hergestellten Bt-Proteine

Die Bioaktivität, d.h. Toxizität der in E.coli hergestellten Bt-Proteine muss an den Zielorganismen getestet werden. Da der Maiswurzelbohrer in Deutschland noch ein Quarantäne-Schädling ist, wird er durch den mit ihm verwandten Kartoffelkäfer ersetzt. Dafür muss zunächst eine Kartoffelkäferzucht etabliert werden. Eine Maiszünslerzucht gibt es am DLR bereits.

Unterschiedliche Konzentrationen der Bt-Proteine werden auf die Nahrungsquelle frisch geschlüpfter Maiszünsler- bzw. Kartoffelkäferlarven aufgebracht. Nach sieben Tagen wird die Anzahl der gestorbenen Larven bei jeder Konzentrationsstufe berechnet und die Sterblichkeitsrate bestimmt.

Um zu überprüfen, ob sich die Bt-Proteine in ihrer Wirkung gegenseitig verstärken, werden diese Versuche auch mit Kombinationen von zwei Proteinen durchgeführt. Diese Tests dienen auch als Grundlage für Untersuchungen von Nicht-Zielorganismen in anderen Teilprojekten.

Bestimmung der Bt-Proteinkonzentration in verschiedenen Pflanzenteilen

Die Konzentration der Bt-Proteine in pflanzlichem Gewebe kann mit Hilfe der Nachweismethode ELISA gemessen werden. Für zwei der drei Bt-Proteine, die von der untersuchten Maissorte produziert werden, müssen die Messmethoden entwickelt und optimiert werden.

Zu drei verschiedenen Wachstumszeitpunkten werden die Bt-Proteingehalte in verschiedenen Pflanzenteilen (Wurzel, Stängel, unteres und oberes Blatt, Pollen, Fruchtfäden und Kolben) ermittelt. Als Bezugsgröße werden Frisch- und Trockengewichte der Proben bestimmt. Es soll untersucht werden, wie hoch die Schwankungen zwischen einzelnen Pflanzen sind und inwiefern die Bt-Proteingehalte in verschiedenen Teilen einer Pflanze korreliert sind.

Ergebnisse

Herstellung der Bt-Proteine

Es wurden jeweils zehn Pflanzen der Bt-Maislinie MON89034xMON88017 sowie der isogenen Linie im Gewächshaus angezogen. Aus den jungen Blättern der Pflanzen wurde die DNA der drei Cry-Gene isoliert, vervielfältigt und die Sequenz bestimmt.

Für die Expression der drei Bt-Proteine wurden Plasmide mit den Bt-Genen hergestellt und in e-coli-Bakterien eingebracht. Zurzeit werden die Expressionsbedingungen und die Reinigung der Proteine optimiert.

Kontrolle der Bioaktivität der hergestellten Bt-Proteine

Für dieCry1- und Cry2-Proteine wurden Vorversuche zur Bioaktivität mit Maiszünslerlarven, für das Cry3-Protein mit Kartoffelkäferlarven durchgeführt. Weitere Bioassays sind geplant, wenn die Reinigung der Toxine abgeschlossen ist.

Bestimmung der Bt-Proteinkonzentration in verschiedenen Pflanzenteilen

Zu Anfang des Längenwachstums und zur Blütezeit wurden auf dem Maisversuchsfeld 2008 insgesamt 816 Wurzel- Blatt- und Stängelproben sowie weitere Pflanzenteile gesammelt und zunächst bei minus 80 Grad gelagert. Mit Hilfe der Nachweismethode ELISA sollen die drei Cry-Proteine in den verschiedenen Pflanzenteilen quantitativ bestimmt werden.