Erzeugung Markergen-freier Gerstepflanzen durch Auskreuzen nach Cotransformation

(2001 - 2004) Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung (MPIZ), Köln

Thema

Es sollte ein System entwickelt werden, mit dem bei einer Agrobakterien -vermittelten Transformation Ziel- und Markergen unabhängig voneinander in das Pflanzengenom eingebaut werden. (Cotransformation)

Ein geeignetes System zur Cotransformation ist Voraussetzung dafür, in der Nachkommenschaft der transformierten Pflanze das Markergen durch Segregation zu eliminieren.
Zudem soll verhindert werden, dass bei der Agrobakterien-vermittelten Transformation unerwünschte DNA übertragen wird. Siehe hierzu: Binäre Vektoren

Informationen zu den Verfahren:

Zusammenfassung

Durch vergleichende Untersuchungen konnte in diesem Projekt gezeigt werden, dass man auf eine sehr einfache Art und Weise durch Kreuzung und anschließende PCR -Analyse Pflanzen ohne Selektionsmarker erzeugen kann.

Besonders einfach erreicht man eine Segregation, wenn man die Cotransformation mit zwei Agrobakterienstämmen durchführt, die jeweils ein Plasmid mit Zielgen bzw. Markergen tragen. Das Besondere dieses Ansatz liegt darin, dass man bei jeder Transformation - auch mit unterschiedlichen Zielgenen - den gleichen Bakterienstamm mit einem optimalen Selektionsmarker verwenden kann. Aufwändiges Klonieren der Plasmide entfällt. Das System ist sofort verwertbar.

Versuchsbeschreibung

Transgene Gerste-Pflanzen im Gewächshaus

Darstellung der Gewebekultur-Schritte bis zum Spross

Es wurde an der Entwicklung von geeigneten binären Vektoren gearbeitet. Zugleich sollten Bedingungen gefunden werden, unter denen diese Vektoren auch zur Transformation einkeimblättriger Pflanzen (Monokotyle) verwendet werden können.

Forschungsprojekt: Optimierung von Vektoren für die Erzeugung Markergen-freier Pflanzen

Dabei wurden zwei Ansätze der Cotransformation verglichen: ein Agrobakterienstamm mit einem Plasmid, das zwei T‑DNA s trägt sowie zwei Agrobakterienstämme mit je einem Plasmid (eins mit dem Zielgen und eins mit dem Selektionsgen).

Anschließend wurden die transgenen Pflanzen zur Segregationsanalyse (Selbstbefruchtung, Kreuzungen) im Gewächshaus abgereift. In der nächsten Generation wurde molekularbiologisch überprüft, wie häufig transgene Pflanzen ohne Selektionsgen auftreten. Die Pflanzen wurden auch molekularbiologisch untersucht (PCR , Southern‑Hybridisierung ).

Durch den Einsatz von so genanntem Embryo Rescue sollte die Aufzucht der nächsten Generation beschleunigt werden.

Ergebnisse

Mit beiden Varianten der Cotransformation wurde Gerste der Sorte Golden Promise transformiert. Es wurden mehr als hundert transgene Pflanzen untersucht. Bei beiden Varianten kam es zur Segregation. Das heißt, es wurden mit der PCR-Methode Pflanzen ohne Selektionsgen aber mit Zielgen gefunden.