Transgene pilzresistente Gerste – Auswirkungen auf Genexpression und Inhaltsstoffe

Thema

Zwei gentechnisch veränderte Gerstenlinien werden hinsichtlich ihres Effekts auf parasitische und nützliche - in Symbiose mit der Pflanze lebende - Pilze untersucht. Eine der Linien bildet eine Chitinase , ein Protein , das die Auflösung der Hyphenwände von pathogenen Pilzen bewirkt. Die andere Linie bildet eine Glukanase , die den Abbau von Glukanen im Gerstenkorn bewirkt. Dadurch wird der Futterwert der Gerste für die Geflügelaufzucht erhöht bzw. ihre Braueigenschaften verbessert. Da Glukane auch Bestandteil der Zellwand von Pilzen sind, könnte diese Gerstenlinie als Nebeneffekt auch pilzresistente Eigenschaften besitzen.

Folgende Fragestellungen werden bearbeitet:

• Wie und in welchem Ausmaß werden transgene Pflanzen von Pilzen befallen? Wird die Wechselwirkung zwischen Pflanze und nützlichen Pilzen im Freiland beeinflusst? (Projektpartner Universität Gießen)

• Wie wirkt sich die Bildung der rekombinanten Proteine auf die Expression anderer Gene und auf die Inhaltsstoffe und die Kornqualität aus? (Projektpartner Universität Erlangen)

Im Folgenden wird das Untersuchungsgebiet der Universität Erlangen beschrieben.

Versuchsbeschreibung

Pflanzenmaterial

Als Pflanzenmaterial stehen zwei transgene Gerstenlinien und ihre nicht-transgenen Ausgangslinien zur Verfügung. Die transgenen Linien wurden von der Washington State University, USA, entwickelt und bereitgestellt. Dort wurde bereits das erhöhte Resistenzpotenzial der Pflanzen, welche die Chitinase enthalten, gegenüber dem wichtigen Schadpilz Rhizoctonia solani in Laborversuchen nachgewiesen.

Verwendete Gene

• Chitinase. In die Pflanzen der ersten Gerstenlinie wurde ein Gen eingebaut, das für das Enzym Chitinase kodiert. Es wird in allen Pflanzenteilen gebildet. Chitinasen bewirken den gezielten Abbau von Chitin, dem wichtigsten Bestandteil pilzlicher Hyphenwände. Das Gen stammt aus einem weltweit vorkommenden nützlichen Bodenpilz (Trichoderma harzianum), welcher auf einer Reihe wirtschaftlich bedeutender pflanzenschädlicher Pilze parasitiert.

• Glukanase. Pflanzen der zweiten Gerstenlinie bilden das Enzym Glukanase. Das Glukanase-Gen stammt aus einem Bodenbakterium (Bacillus amyloliquefaciens) und wurde in Gerste eingebracht, um die Futterqualität von Gerste für die Geflügelzucht zu verbessern. Sie erhöht die Verdaulichkeit der Gerste, die bislang als Tierfutter nur bedingt einsetzbar war.
  Das Transgen ist lediglich im Endosperm des Gerstenkorns (Nährgewebe im keimenden Samen) aktiv. Jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Glukanase in den Boden gelangen könnte. Da das Enzym die Hyphenwände bestimmter Pilze durch den Abbau von Glukanen auflöst, könnte die Besiedlung der Wurzel durch nützliche wie schädliche Pilze gleichermaßen beeinflusst werden.

Gewächshaus und Freiland

Es werden Gewächshaus- und Freilandversuche durchgeführt.

Für die Versuche im Gewächshaus werden die transgenen Gerstenlinien mit zwei Parasiten (Rhizoctonia solani bzw. Fusarium graminearum) und einem nützlichen Pilz (Piriformospora indica) infiziert. Mit P. indica besiedelte Pflanzen zeigen eine Reihe positiver Effekte wie etwa verstärktes Wachstum, erhöhte Resistenz gegen Pathogene oder gegen Trockenstress.

Um eine mögliche Korrelation zwischen Effekten auf den Stoffwechsel und der Expression der Transgene festzustellen, werden Gerstenlinien, die Chitinase in drei unterschiedlichen Mengen bilden, eingesetzt. Weiterhin werden eine Glukanase bildende Linie und die Ausgangslinien verwendet.

Die Freilandversuche finden auf dem Gelände der Universität Gießen statt. Von 2006 bis 2008 werden die zwei transgenen Gerstenlinien und ihre nicht-transgenen Ausgangslinien auf Parzellen von je zwölf Quadratmetern ausgesät und untersucht. Die Gerstenlinien werden mit bzw. ohne einen kommerziell erhältlichen Mykorrhizapilz kultiviert. Dieser wird vor der Aussaat in den Boden eingearbeitet.

Analyse von Stoffwechselprodukten

Mit biochemischen Trennungsverfahren (HPLC) werden Profile erstellt, die quantitative Unterschiede in der Anhäufung von Stoffwechselprodukten (Metabolite) aufdecken können. Metabolite mit quantitativen Abweichungen werden selektiert und analysiert (spektroskopische Techniken).

Erstellung von Transkription sprofilen

Die Einführung fremder Gene und ihrer Produkte kann unerwartete Veränderungen im Genexpressionsmuster zur Folge haben.

Hier interessieren folgende Fragestellungen:

• Gibt es Unterschiede im Transkriptionsmuster transgener und nicht-transgener Pflanzen?

• Wenn ja, wie beeinflussen die Resistenzgene die Transkription anderer Gene, die im Zusammenhang mit pflanzlichen Abwehrmechanismen stehen?

Um den möglichen Einfluss der beiden Resistenzgene zu ermitteln, werden Transkriptionsprofile erstellt. Mit Hilfe von DNA-Microarrays wird analysiert, wie stark ein Gen unter bestimmten Bedingungen abgelesen (transkribiert) wird. Durch den Vergleich der Transkriptionsstärke zwischen transgenen und nicht-transgenen Pflanzenzellen sollen Abweichungen ermittelt werden.

Für die Erstellung der Transkriptionsprofile wird RNA aus Gewebeproben der transgenen und nicht-transgenen Pflanzen zu drei verschiedenen Zeitpunkten während des Pflanzenwachstums extrahiert. Die Gerstenlinien werden mit bzw. ohne einen kommerziell erhältlichen Mykorrhizapilz kultiviert. Dieser wird vor der Aussaat in den Boden eingearbeitet.

Quantitative und qualitative Messung der Gerstenkörner

Die Expression der Resistenzgene kann auch Einfluss auf die Inhaltsstoffe und die Zahl und das Gewicht der Gerstenkörner ausüben. Daher sollen entsprechende Daten erhoben werden.

Ergebnisse

In der ersten Phase des Projekts wurden Methoden zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten in Gerstenblättern etabliert. Da fast jede zu messende Stoffklasse ein eigenes Aufschlussverfahren benötigt, aber nur begrenztes Probenmaterial zur Verfügung steht, war es nötig die Aufschlussmethoden dahingehend zu optimieren, mit wenigen Methoden möglichst viele Stoffklassen abdecken zu können. Daher wurde mit gesondert angebautem nicht-transgenen Pflanzenmaterial eine große Anzahl an Vorexperimenten durchgeführt. Die Auswertung dieser Versuche ergab, dass die für die Analyse der Stoffwechselprodukte angepassten Methoden geeignet sind.

In der Folge wurden mit diesen Methoden die transgenen und nicht-transgenen Gewächshausproben, die mit parasitären Pilzen bzw. mit einem nützlichen Pilz infiziert waren, auf unterschiedliche Stoffwechselprodukte hin untersucht.

Die Auswertung der ersten Daten zeigte, dass unter Feldbedingungen die Gerstensorte sowie die Stärke des Pilzbefalls über die gemessenen Stoffwechselprodukte und Transkriptionsprofile unterschieden werden können. Eine transgen-bedingte Veränderung konnte nicht belegt werden. Diese Ergebnisse sollten in einem zweiten Versuchsdurchlauf bestätigt werden.

Da durch in den Jahren 2006/2007 begangene Feldzerstörungen eine Wiederholung der Versuche nicht möglich war, wurden begrenzte Gewächshausversuche zur Wiederholung angelegt, um statistisch relevante Aussagen machen zu können. Die Auswertung der wiederholten Versuche ist noch nicht abgeschlossen. Die Ergebnisse werden im Frühsommer 2009 erwartet.

Mehr bei bioSicherheit

• Transgene pilzresistente Gerste - Auswirkungen auf pathogene und nützliche Pilze, Universität Gießen