Markergenelimierung mit dem Ac/Ds-Transposonsystem in Zuckerrübe

(2005 - 2008) Technische Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, Institut für Genetik

Thema

Zukünftige gentechnisch veränderte Pflanzen sollen nur noch solche Fremdsequenzen enthalten, die für die unmittelbare Funktion benötigt werden. Mit Hilfe des Ac/Ds-Transposon-Systems ("Springende Gene") können Pflanzen hergestellt werden, die nur noch das Zielgen enthalten und frei von zusätzlichen Sequenzen sind, beispielsweise von Markergenen .

Im Vorgängerprojekt wurde das Ac/Ds-System erfolgreich in die Zuckerrübe integriert. Die Transposition (Springen) des verwendeten Reporter‑Gens an eine andere Stelle im Pflanzengenom konnte nachgewiesen werden.

In diesem Projekt sollen die Nachkommen hinsichtlich der Transpositionsfrequenz und des Integrationsortes weiter untersucht werden.

Ein weiteres Ziel ist die Optimierung des Ac/Ds-Systems in der Zuckerrübe, um innerhalb einer Generation markergenfreie transgene Pflanzen zu erzeugen. Zudem soll die Transposition in der transgenen Zuckerrübe nur einmal stattfinden und weitere verhindert werden.

Vorläuferprojekt:

Forschungsprojekt: Eliminierung überflüssiger Gensequenzen bei Zuckerrübe; Planta, Einbeck

Informationen zum Verfahren:

Springende Gene: Vom Phänomen zum Werkzeug

Zusammenfassung

Grundsätzlich findet mit den hier verwendeten Vektorkonstrukten eine Transposition von Ac/Ds in der Zuckerrübe statt.
Es konnte in transgenen Arabidopsis-Pflanzen gezeigt werden, dass sich die Bildung der Transposase reduzieren lässt. Damit besteht die Möglichkeit, weitere Transpositionen zu vermeiden.
Das Projektziel - Bestimmung der Transpositionsfrequenz - musste wegen Pilzbefall des Saatgutes verworfen werden.
Eine weitere Optimierung des Ac/Ds-Systems konnte aus Zeitgründen nicht verwirklicht werden.

Versuchsbeschreibung

Die Blätter junger Zuckerrübenpflanzen werden mit dem Herbizid Phosphinothricin betropft.

Ist das Reportergen nicht mit Hilfe des Ac/Ds-Systems an eine andere Stelle im Genom gesprungen, sterben die Blätter nach einigen Tagen ab. Nur nach erfolgreicher Transposition sind die Pflanzen resistent gegen das Herbizid.

In diesem Projekt werden zum einen die Nachkommen des Vorgängerprojektes weiter untersucht, zum anderen werden eigene transgene Zuckerrüben hergestellt, an denen das optimierte Ac/Ds-System getestet werden soll.

(1) Untersuchungen zur Transposition. Bei den direkten Nachkommen des Vorgängerprojektes wird zunächst die Transpositionsfrequenz bestimmt, indem die Nachkommen darauf getestet werden, ob sie Resistenz gegenüber dem Herbizid (Phosphinothricin; Ppt) besitzen. Dafür wird auf die Blätter junger Pflanzen Ppt getropft.

Sind die Pflanzen nicht resistent, verfärben sich die Blätter nach zwei Tagen weiß und sterben nach weiteren zwei Tagen ab.
Bei den resistenten Pflanzen, in denen die Transposition erfolgreich stattgefunden hat, sind keine Veränderungen zu beobachten. Im Zuge der Transposition ist hier das Reportergen an eine andere Stelle im Genom gesprungen, wodurch die Pflanze ein Enzym bilden kann, das das Herbizid Phosphinothricin in eine biologisch unwirksame Form umwandelt. Das Verhältnis der resistenten zu den nicht-resistenten Pflanzen gibt Aufschluss über die Häufigkeit der Transposition (Transpositionsfrequenz).

Anschließend erfolgt die Analyse des Integrationsortes , in den das Ds-Element transponiert (gesprungen) ist. Er wird mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer Methoden näher charakterisiert, unter anderem mit inverser PCR und Southern Blot .

(2) Optimierung des Ac/Ds-Systems. Nach der ersten Transposition sollen weitere in der bereits transformierten Zelle unterbunden werden. Dafür werden verschiedene Vektorkonstrukte hergestellt, die alle die vollständigen Komponenten für die Markergeneliminierung mittels Ac und Ds enthalten. Zudem wird in die Vektorkonstrukte jeweils ein weiteres Gen integriert, mit dem die Aktivität der Transposase stark herunterreguliert beziehungsweise vollständig unterbunden werden soll - und zwar dann, wenn die erste Transposition des Ds-Elemets stattgefunden hat. Die Transposase ist das Enzym, welches die Enden der Ds-Sequenz erkennt, an dieser Stelle die DNA schneidet und damit die Transposition auslöst.

Nach der erfolgten Transposition befinden sich Ziel- und Markergen im Pflanzengenom an getrennten Stellen. Jetzt können aus dieser Pflanze durch natürlich stattfindende Segregationsprozesse Nachkommen erzeugt werden, die nur das Zielgen, jedoch nicht mehr das Markergen besitzen.

Die Vektorkonstrukte werden in der Zuckerrübe auf ihre Funktionalität hin getestet. Zudem soll das System in Zukunft weiteren Kulturarten zur Verfügung stehen.

Ergebnisse

Nachweis der Ac/Ds-Transposition in Zuckerrüben. Für die Untersuchungen wurde Saatgut verwendet, dass aus Kreuzungen und mit sich selbst befruchteten Pflanzen von transgenen Zuckerrüben-Pflanzen stammt, die mit Ac- und Ds-Elementen transformiert wurden. Im ersten Projektjahr 2005 wurden Segregationsanalysen der Zuckerrüben-Nachkommen auf Selektionsmedien durchgeführt. Die Untersuchungen ergaben keinen Aufschluss über die gesuchten Transpositionsereignisse, da die Saatgutqualität ungenügend (Pilzbefall) und die Selektion auf Antibiotika-haltigem Medium nicht eindeutig war. Um dennoch die Pflanzen zu ermitteln, die transponierte Elemente ohne zusätzliche Sequenzen enthalten, mussten sie daher im Laufe des zweiten Projektjahres (2006) zunächst in Erde angezogen werden. Nach DNA-Isolierung wurde von jeder Pflanze mittels PCR-Analyse der transgene Hintergrund festgestellt. Es konnten Pflanzenlinien ermittelt werden, die ein transponiertes (gesprungenes) Ds-Element enthalten.

Die Analyse der Transpositionshäufigkeit sollte ebenfalls durch Segregation auf Selektionsmedien durchgeführt werden. Die schlechte Saatgutqualität hat dazu geführt, dass dieses Projektziel verworfen werden musste.

Für die Untersuchung der Integrationsstelle wurde DNA aus den Pflanzen entnommen, bei denen das Ds-Element nachgewiesen wurde. Mittels inverser PCR konnte ein Integrationsort nachgewiesen werden.

Vektorkonstrukte zur Optimierung des Ac/Ds-Systems. Es wurden Vektor-Konstrukte erstellt, die aus Ac/Ds-Elementen, dem Ac-Transposase regulierenden Gen sowie einem Reportergen (GUS-Gen) bestehen. In Anwesenheit eines Substrates färben sich die Zellen, in denen das Reportergen aktiv ist, blau. Da das Reportergen an das Ac-Transposase regulierende Gen gekoppelt ist, kann dessen Aktivität mit Hilfe der Färbung analysiert werden. Zum Vergleich wurde zusätzlich ein Konstrukt erstellt, das kein Ac-Transposase regulierendes Gen enthält. Beide Konstrukte wurden in einen T‑DNA -Vektor eingebaut und mittels Agrobakterien in die Modellpflanze Arabidopsis thaliana transformiert. Durch Selbstbestäubung wurde die erste Nachfolgegeneration gezüchtet. In diesen Nachkommen wurde dann die GUS-Aktivität bestimmt. Diese zeigte sich in den meisten Linien als sehr unterschiedlich, unabhängig davon, ob die Pflanzen das Enzym-regulierende Gen enthielten. Mit Hilfe molekularbiologischer Untersuchungen (PCR) wurde nachgewiesen, dass die Transposase-Menge reduziert wird. Es ist möglich, das diese reduzierte Enzym-Menge für weitere Transpositionen nicht ausreicht.

Die Transformation der Konstrukte in Zuckerrübenpflanzen schlug fehl.