Gezielter Einbau von Genen mittels Gene Targeting

(2005 - 2008) Universität Karlsruhe (TH), Botanisches Institut II

Thema

Durch ein bestimmtes Restriktionsenzym namens I-SceI kann im Pflanzengenom gezielt ein DNA -Bruch hervorgerufen werden, der sich anschließend durch homologe oder illegitime Rekombination wieder schließt. Wie im Vorläuferprojekt gezeigt wurde, können mit dieser Technik beispielsweise Markergene aus dem Genom transgener Pflanzen entfernt werden.
Über Homologien in einem vorhandenen DNA-Abschnitt kann gezielt DNA an diese Stelle im Pflanzengenom eingebaut werden (Gene Targeting ).

Beide Ansätze, die gezielte Integration von Genen an einer bestimmten Stelle im Genom und die Entfernung des Markergens, sollen miteinander verknüpft werden. Ziel ist ferner die Etablierung eines effizienten und kultursortenunabhängigen Systems. Getestet wird dieses jedoch zunächst an den beiden Kulturarten Tabak und Arabidopsis thaliana .

Vorläuferprojekt:

Gezielter Einbau von Genen an bestimmten Stellen im Pflanzengenom

Weiter Informationen zu den Verfahren:

Zusammenmfassung

Für die Modellpflanzen Arabidopsis thaliana und Tabak sollte ein System etabliert werden, welches eine zielgerichtete Integration von Genen im Pflanzengenom erlaubt. Die experimentelle Strategie besteht darin, in vivo ein lineares DNA-Molekül (Donorsequenz) mit Hilfe einer hochspezifischen molekularen Schere aus dem Pflanzengenom herauszuschneiden und dessen ortsspezifische Integration (Gene Targeting) an einer bekannten Zielsequenz nachzuweisen. Solche Gene Targeting–Ereignisse würden in dem verwendeten experimentellen System zur Entstehung eines intakten Kanamycin‑Resistenzgens führen und eine Selektion auf Pflanzen erlauben, bei welchen die angestrebte Reaktion stattgefunden hat.

Für beide verwendeten Kulturarten ist es gelungen, die lineare DNA-Sequenz in vivo aus dem Genom herauszuschneiden, wobei dies insbesondere bei Arabidopsis thaliana mit sehr hoher Effizienz gelang. Dies zeigt, dass das Herausschneiden von DNA-Abschnitten aus dem Genom in lebenden Pflanzen sehr erfolgreich durchgeführt werden kann. Unter den gewählten experimentellen Bedingungen wurden jedoch für beide Kulturarten keine Kanamycin-resistenten Pflanzen erhalten. Die gezielte Integration eines homologen DNA-Abschnitts konnte daher bis zum Abschluss des Projektes nicht nachgewiesen werden.

Auf Grund der sehr vielversprechenden Ergebnisse hinsichtlich des Herausschneidens der Donorsequenz aus dem Arabidopsis-Genom werden weitere Untersuchungen unter Verwendung einer modifizierten experimentellen Strategie durchgeführt.

Versuchsbeschreibung

In der Pflanze soll mittels Gene Targeting eine Gensequenz, die Targeting-Sequenz, gezielt in eine vorhandene Gensequenz, den Target Locus, integriert werden. Die Targeting-Sequenz ist die Sequenz zwischen den beiden I-SceI-Schnittstellen. Um das System zu testen, trägt er innerhalb der Schnittstellen in diesem Fall einen Teil des Kanamycin-Resistenzgens (KA). Außerhalb der Schnittstellen liegt zudem je ein Teil des GUS-Gens (blau), der für die spätere Farbreaktion von Bedeutung ist. Der Target Locus ist der Ziel-Integrationsort im Pflanzengenom und trägt den zweiten Teil des Kanamycin‑Resistenzgens (rot, NA).

Um die Targeting-Sequenz gezielt in den Target Locus zu integrieren, werden folgende Schritte sowohl mit Tabakpflanzen als auch mit Arabidopsis thaliana durchgeführt:

(1) Herstellung unabhängiger transgener Pflanzenlinien. Zunächst werden der Targeting Vektor und der Target Locus in zwei unterschiedliche Pflanzenlinien transformiert:

Eine Pflanzenlinie trägt den Targeting Vektor. Dieser ist dabei von einem Farb-Markergen umschlossen, dem GUS-Gen. Damit kann später geprüft werden, ob die Targeting-Sequenz erfolgreich aus dem Genom der transgenen Pflanze herausgeschnitten wurde.
Die andere Pflanzenlinie trägt den Target Locus. Zusätzlich wird eine das Restriktionsenzym I-SceI kodierende Sequenz übertragen, welches später im generativen Gewebe der Pflanzen aktiv wird damit das Gene Targeting ermöglicht.

Mit Hilfe molekularbiologischer Methoden werden in beiden Pflanzenlinien diejenigen Pflanzen ausgesucht, die das jeweilige Transgen nur einmal in ihr Genom integriert haben.

(2) Kreuzung der beiden Pflanzenlinien. Beide Pflanzenlinien werden miteinander gekreuzt. Die Nachkommen werden zum Teil auf kanamycinhaltigem Boden ausgesät und auf ihre Resistenz hin überprüft. Pflanzen, die auf diesem Nährboden überleben, besitzen das Resistenzgen. Bei diesen war das Gene Targeting erfolgreich.

Ein zweiter Teil der Pflanzen wird auf einem Medium ohne Kanamycin ausgesät. Mit einer Farbreaktion werden die Pflanzen bestimmt, die die Targeting-Sequenz erfolgreich herausgeschnitten und das GUS-Gen repariert haben.

Das Verhältnis der Anzahl der Pflanzen, aus denen die Targeting-Sequenz erfolgreich herausgeschnitten wurde, zu den Pflanzen, bei denen das Kanamycin-Resistenzgen erfolgreich restauriert wurde, gibt Auskunft über die Effizienz des Gene Targeting-Systems.

(3) Überprüfung der Orte der homologen Rekombination. Die Pflanzen, in denen das Kanamycin-Resistenzgen erfolgreich restauriert wurde, werden weiter molekularbiologisch untersucht um festzustellen, ob die Targeting-Sequenz vollständig in den Target Locus integriert wurde.

Ergebnisse

(1) Herstellung unabhängiger transgener Pflanzenlinien.

Im ersten Projektjahr (2005) wurden die Konstrukte Targeting Vektor und Targeting Locus hergestellt. Mittels Agrobakterien wurden sie in Tabakpflanzen und Arabidopsis thaliana eingebracht. In der ersten Nachkommenschaft der beiden Organismen konnten diese Konstrukte bereits identifiziert werden.

Im folgenden Jahr (2006) wurden weitere Pflanzen transformiert. Das Saatgut dieser Pflanzen wurde solange kultiviert und selektiert, bis das jeweilige Transgen nur einmal im Genom vorhanden war. Für Tabak konnten sechs Linien mit dem Targeting Vector und fünf mit dem Targeting Locus identifiziert werden, bei Arabidopsis enthielten jeweils vier Linien eins der beiden Konstrukte.

Die Blaufärbung der jungen Arabidopsis- Pflanzen (ca. vierzehn Tage jung) zeigt eine erfolgreiche Rekombination an. Die Targeting-Sequenz wurde herausgeschnitten und damit das an der Farbreaktion beteiligte GUS-Gen repariert.

Nachkommen der Arabidopsis- Kreuzungen auf Kanmycin- Selektionsmedium.

Zellkultur von Arabidopsis- Blättchen. Bei drei untersuchten Linien der potentiellen Gene Targeting-Linien ist zu erkennen, dass die Blätter abgestorben sind.

Grafik und Fotos:
Prof. H. Puchta, Universität Karlsruhe

Anschließend wurde in alle Targeting Locus-Linien das Gen mit der I-SceI kodierenden Sequenz eingebracht. Bei Arabidopsis wurde die Gensequenz unter die Kontrolle von jeweils drei verschiedenen Promotoren gestellt. In Tabak kamen I-SceI-Konstrukte mit zwei verschiedenen Promotoren zum Einsatz. Diese erneut transformierten Linien werden zur Zeit daraufhin geprüft, ob die I-SceI kodierenden Sequenz nur einmal im Genom vorhanden ist.

Parallel zu diesen Arbeiten wurde in den Targeting Locus-Linien von Arabidopsis und Tabak auch ein induzierbares Promotorsystem getestet. Für Arabidopsis konnte aber gezeigt werden, dass dieser Promotor auch ohne äußere Einflüsse die Expression des I-SceI-Gens hervoruft. Dieses System wurde daraufhin für ein Gene Targeting verworfen.

(2) Kreuzung der beiden Pflanzenlinien.

Im dritten Projektjahr (2007) wurden Tabak- bzw. Arabidopsis-Pflanzen, welche die Konstrukte Targeting Vektor bzw. Targeting Locus mit der molekularen Schere I-SceI enthielten, miteinander gekreuzt.

Für die Nachkommen der gekreuzten Arabidopsis-Linien konnte gezeigt werden, dass die Targeting-Sequenz sehr effizient aus dem Targeting Vektor herausgeschnitten wurde., was durch eine massive teilweise ganze Blätter betreffende Blaufärbung nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz dazu wurden bei den Experimenten mit Tabak nur wenige blaue Areale detektiert, was darauf hindeutet, dass das Herausschneiden einer linearen Donorsequenz im Tabak-Genom einen limitierenden Faktor darstellt.

Die Pflanzen-Linien wurden durch Selbstung (Selbstkreuzung) vermehrt und das Saatgut der Folgegeneration auf Kanamycin-haltigem Selektionsmedium ausgebracht. Hierbei wurden zahlreiche Pflänzchen identifiziert, die auf diesen Nährböden wuchsen. Alle diese Pflanzen wurden mit Hilfe molekulargenetischer Methoden untersucht. Überraschenderweise wurden weder bei Arabidopsis noch bei Tabak Gene Targeting-Ereignisse gefunden. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte darin liegen, dass es zwar zu ortsspezifischen Integrationen und damit zur Restauration eines funktionellen Kanamycin-Resistenzgens kommt, dessen Expression aber zu schwach ist, um eine Selektion auf Sämlingsebene zu ermöglichen.

Um potentiell Kanamycin-resistente Zellen selektiv anzureichern wurde daher die experimentelle Strategie für beide Kulturarten geändert. Pflanzen-Linien aus Kreuzungen, welche sowohl den Targeting Locus als auch den Targeting vector enthielten, wurden mit einem I-SceI-Konstrukt transformiert und über zwei Generationen mit entsprechenden Selektions-Schritten vermehrt.

Anschließend wurden Blättchen abgeschnitten und auf Zellkulturmedium überführt. Bei Tabak konnte die Effizienz des Herausschneidens der Targeting-Sequenz durch die veränderten Bedingungen nicht gesteigert werden und es wurden keine Kanamycin-resistenten Zellkulturen erhalten. Daher wurden die Arbeiten mit Tabak eingestellt.

Da bei der Modellpflanze Arabidopsis das Herausschneiden der linearen Targeting-Sequenz nicht limitierend ist, soll durch weiter veränderte Zellkulturprotokolle versucht werden, auch nach dem offiziellen Abschluss des Projektes Hinweise auf eine gesteigerte Gene Targeting-Effizienz zu finden.