Direkt in den Zellkern

Ralf Schindler, Mitarbeiter des Projektes, hat interessante Filmsequenzen einer Mikroinjektion zur Verfügung gestellt und kommentiert:

Prinzipiell können alle Arten von lebenden Pflanzenzellen mikroinjiziert werden. Voraussetzung ist, dass sie der Mikrokapillare - ein sehr feines sich verjüngendes Glasröhrchen - zugänglich sind und im Mikroskop beobachtet werden können. In unserem Falle werden Kallus zellen injiziert. Zur mechanischen Fixierung werden diese Zellen in Agar eingegossen. Um ein Austrocknen der Zellen, die dicht an der Oberfläche des Agars oder darüber liegen, zu verhindern, aber auch um optimale Sichtverhältnisse zu haben, erfolgt die Injektion unter einem wässrigen Medium.

Im Gegensatz zu tierischen Zellen haben Pflanzenzellen eine Zellwand und einen hohen Innendruck (Turgor). Dieser Innendruck beträgt in der Regel acht bar(!) und kann – je nach den Umgebungsbedingungen – in einem Rahmen von mehreren bar variieren. Um eine Lösung ins Innere dieser Zellen zu bringen, muss diesem Innendruck ein geringfügig höherer Druck (um ca. 50-100mbar) in der Kapillare entgegengesetzt werden.

Der hohe Druckunterschied zwischen innen und außen stellt eine zusätzliche Schwierigkeit bei der Mikroinjektion dar: Nach dem Zurückziehen der Kapillare kann eine große Menge Zellmaterial durch das von der Injektion zurückbleibende Loch in der Zellwand nach außen geschleudert werden. Schlimmstenfalls kann sogar der Zellkern dabei durch die kleine Injektionsöffnung nach außen gepresst werden. Um das zu vermeiden, muss die Injektionsöffnung möglichst kleingehalten werden.

Deshalb verwenden wir Kapillaren mit einer sehr geringen Mündungsweite von ca. 100nm. Zum Vergleich: Bei der Mikroinjektion tierischer Zellen sind 500-1000nm üblich. Und wir versuchen, bei der Injektion die Kapillare - die sich von der Mündung aus zunehmend im Durchmesser erweitert - nur eine möglichst kurze Strecke in die Zelle einzuführen. Außerdem werden die Kapillare mit Silan beschichtet, das ist ein spezieller Stoff, der ein Ankleben von Zellbestandteilen, aber auch von der in der Injektionslösung enthaltenen DNA verhindert.

PicoGreen und TexasRed

Die Injektionslösung enthält im wesentlichen DNA-Lösung sowie die beiden Farbstoffe PicoGreen und TexasRed.

PicoGreen ist ein Farbstoff, der spezifisch an DNA bindet. Wichtig: Er fluoresziert nur im DNA-gebundenen Zustand (grün). Der Injektionslösung ist er in einer Konzentration zugesetzt, die sicherstellt, dass er vollständig an die darin enthaltene DNA gebunden vorliegt. Er dient dem Zweck, die Injektion der DNA in den Zellkern beobachten und kontrollieren zu können.

TexasRed ist ein bei Anregung mit grünem Licht rotfluoreszierender Farbstoff, der (in seiner unmodifizierten Form) nicht an spezifische Zellbestandteile bindet. Das Molekulargewicht von TexasRed ist klein. Daher diffundiert dieser Farbstoff schnell und verteilt sich nach einer gewissen Zeit gleichmäßig über die gesamte Zelle. Dieser Farbstoff ist im Injektionsgemisch vorhanden, um die injizierten Zellen später wiederzufinden und selektieren zu können.

Dieses Injektionsgemisch wird vor dem Einfüllen in die Kapillare etwa drei Stunden lang zentrifugiert, um Partikel, die die Kapillare verstopfen könnten, aus der Lösung zu entfernen.