Neue Markergene

Negative Marker: Wer ihn hat, stirbt ab

Das Ziel: gentechnisch veränderte Pflanzen, in denen die bei der Transformation erforderlichen Markergene nicht mehr vorhanden sind. Die Idee: negative Selektionsmarker.

Nachdem die transformierten Zellen mit Hilfe der der Markergene identifiziert worden sind, werden sie in der gentechnisch veränderten Pflanze nicht mehr benötigt. Bisher bereitet es jedoch einige Schwierigkeiten, Markergene wieder zu entfernen. Eine mögliche Methode, dieses Ziel zu erreichen, ist der Einsatz negativer Selektionsmarkern. Damit sollen Pflanzen, die das Markergen tragen, auf ein bestimmtes "chemisches Signal" aussortiert werden.

Schaubild: Keimzellen von Pflanzen mit unabhängig integriertem Zielgen und Markergen-Kassette

In den Keimzellen liegt der in der Regel doppelte Chromosomensatz nur einfach vor. Es sind verschiedene Kombinationen von Zielgen (Z) und Markergen-Kassette
(+ = Antiobiotikaresistenz- Gen,
- = negativer Selektionsmarker) möglich. Einige Keimzellen haben auf ihren Chromosomen weder Zielgen, noch Markergen-Kassette.

Einige Nachkommen tragen nur das Zielgen. In allen anderen ist die Markergen-Kassette vorhanden.

Der erste Schritt: Cotransformation. In Pflanzenzellen werden das Zielgen und eine "Marker-Kassette" getrennt voneinander eingeschleust, so dass sie an verschiedenen, möglichst weit voneinander entfernten Orten im Genom der Pflanze eingebaut werden. (Cotransformation) Die Marker-Kassette enthält das zunächst benötigte Markergen sowie den negativen Selektionsmarker..

Der zweite Schritt: Nachkommen. Sind das Zielgen und die Marker-Kassette unabhängig im Pflanzengenom integriert, verteilen sie sich unterschiedlich auf die Nachkommen (Segregation ). So wird es Pflanzen geben, die nur das Zielgen besitzen, aber auch solche mit Zielgen und Marker-Kassette.

Dritter Schritt: Aktivierung des negativen Selektionsmarkers. Jetzt kommt der negative Marker zum Zuge. Durch ein Signal (= Induktorsubstanz) wird der negative Marker aktiv und alle Pflanzen sterben ab, die diesen Marker tragen. Übrig bleiben dabei die Pflanzen, die nur das Zielgen tragen und solche, bei denen durch die Segregation alle Fremdgene verloren gegangen sind.

Anwendung. In einem Projekt des 2003 abgeschlossenen SiFo-Programms wurden ein solches negatives Selektionssystem weiterentwickelt und auf seine Praxistauglichkeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Selektionssystem für Pflanzen geeignet ist. Für einen breiten Einsatz muss das Verfahren – insbesondere die Reinheit der Induktorsubstanz - jedoch noch optimiert werden.

In dem näher untersuchten System dient das Enzym N-Acetyl-Phosphinothricin-Deacetylase (= DEA) als negativer Selektionsmarker . Dieses wandelt eine für die Pflanze ungiftige in eine giftige Substanz um. Im Fall des DEA wird aus einer inaktiven Form eines Herbizids (N-Acetyl-Phosphinothricin) ein wirksames Herbizid (Phosphinothricin), das in den zentralen Stoffwechsel der Pflanze eingreift und sie abtötet. (siehe Schaubild unten)

Behandelt man die transgenen Nachkommen mit dem inaktiven Herbizid, werden jene absterben, in denen der negative DEA-Selektionsmarker vorhanden ist. Pflanzen, denen das inaktive Herbizid nichts anhaben kann, bleiben unverändert. Sie sind Markergen-frei.

System des induzierbaren Zelltods. Die Pflanze, die das DEA-Gen trägt, stirbt nach Applikation einer Induktorsubstanz ab. Diese Substanz ist ein für Pflanzen nicht toxisches und biologisch abbaubares Derivat des Herbizids Phosphinothricin (= Glufosinat, Liberty). Die Pflanzen nehmen den Induktor über Blüten und Blätter auf und transportieren die Substanz vorzugsweise in Richtung der Sprossspitze. Hier verbleibt die Substanz solange unverändert, bis sie durch das DEA-Enzym in das aktive Herbizid umgewandelt wird. Durch Kopplung mit dem zu eliminierenden Markergen sterben alle Pflanzen ab, die beide Markergene enthalten.

Negative Marker: Wer ihn hat, stirbt ab

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