Markergen-Eliminierung

Rekombination: Neue Arrangements der Gene

Rekombination gibt es nicht nur im Labor. Bei diesem natürlichen Vorgang werden DNA-Abschnitte ausgetauscht und neu zusammengefügt. Rekombination ist eine der Ursachen für die genetische Variabilität der Organismen. Besonders häufig kommt Rekombination bei Bakterien vor. Deren Werkzeuge werden genutzt, um in Pflanzen unerwünschte Markergene zu entfernen. Erste Pflanzen, bei denen solche Systeme abgewandt wurden, befinden sich bereits im europäischen Zulassungsverfahren.

Es gibt mehrere Möglichkeiten und Mechanismen der Rekombination - eine davon ist die homologe Rekombination. Voraussetzung dafür sind DNA -Abschnitte mit gleicher oder sehr ähnlicher Abfolge der DNA-Bausteine. Diese homologen DNA-Sequenzen können zwischen zwei Strängen ausgetauscht werden. Möglich ist auch, dass andere DNA-Bereiche, die zwischen solchen homologen Sequenzen liegen, aus einem Strang herausgeschnitten und in den anderen eingefügt werden können. (siehe Schaubild)

Anders als bei Tieren und Bakterien kommt die homologe Rekombination bei Pflanzen nur selten vor. Man versucht daher, das bakterielle Rekombinationssystem auf Pflanzen zu übertragen, um es sowohl zum Entfernen von Markergenen zu nutzen, als auch für einen gezielten Einbau von DNA-Sequenzen in das Genom.

Die bakteriellen Rekombinationssysteme bestehen aus zwei Komponenten:

• Rekombinase, ein Enzym : Da diese in Pflanzen normalerweise nicht vorhanden ist, wird das Gen in die Pflanzen eingeschleust.

• bestimmte, als Sites bezeichnete Erkennungssequenzen: Die Rekombinase erkennt "ihre" Sites und vermittelt die Rekombination. Eine DNA-Sequenz, die zwischen den Sites liegt, wird aus dem DNA-Strang herausgeschnitten und kann an anderer Stelle - ebenfalls zwischen zwei Sites - wieder eingebaut werden.

Um Rekombinationssysteme zur Eliminierung von Markergenen in transgenen Pflanzen zu nutzen, sind mehrere Schritte erforderlich:

• Zunächst werden transgene Pflanzen mit einem von den Sites eingerahmten Markergen hergestellt. Wenn das Markergen wieder entfernt werden soll, wird in die Pflanzen zusätzlich das Rekombinase-Gen eingeführt.

• In Nachkommen, die sowohl Markergen als auch Rekombinase-Gen besitzen, wird das Markergen entfernt.

• Das Rekombinase-Gen kann z.B. durch Segregation in der nächsten Generation wieder entfernt werden.

Man kennt inzwischen mehrere Rekombinationssysteme. Zwei davon wurden in Projekten der Sicherheitsforschung untersucht, ob sie sich in der Praxis zur Entfernung von Markergenen eignen. Die Ergebnisse liegen inzwischen vor. Ein weiteres Rekombinationssystem ist Gegenstand eines aktuellen, 2005 begonnenen Forschungsprojekts.

• Das cre/lox-System stammt aus dem Bakteriophagen P1. Es besteht aus der Rekombinase Cre und den lox-Sites. Je nach Orientierung der lox-Stites wird das dazwischen liegende Gen entweder herausgeschnitten oder umgedreht (Inversion).
  Dieses System wurde bei Tabak, Zuckerrübe und Kartoffel eingesetzt. Insbesondere bei Kartoffeln gelang es, markerfreien transgenen Pflanzen zu erzeugen. Da die Ergebnisse erfolgversprechend waren, werden die Untersuchungen fortgesetzt.
  Inzwischen befinden sich gv-Maispflanzen im europäischen Zulassungsverfahren, bei denen das Markergen mit Hilfe des cre/lox-Systems entfernt wurde.

• Das ebenfalls bakterielle Resolvase/res-System funktioniert ähnlich. Es schneidet die Gene nur heraus, ohne sie umzudrehen.Das Schneide-Enzym ist hier eine Resolvase, die dazu passenden Markierungs-Sites sind res-Sequenzen. (siehe Schaubild)
  In einem abgeschlossenen SiFo-Projekt konnte die Funktionalität des Resolvase/res-Systems in Kartoffel-Protoplasten nachgewiesen werden. Außerdem wurde das System für die spezifischen Bedingungen bei Kartoffelpflanzen optimiert.

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